Intorno al 1576 si provvide ad espropriare definitivamente i terreni dove sarebbe dovuto sorgere il nuovo centro urbano, in linea col progetto di Francesco I di creare una città porto per Pisa, prevedendo – conformemente al progetto dell’architetto Bernardo Buontalenti - l’edificazione di un nucleo fortificato a forma di pentagono irregolare nella quale inglobare il preesistente sobborgo medievale. Si ricordi, per altro, che l’interesse di Firenze per il porticciolo livornese, sia sotto un aspetto strategico che economico-commerciale (quale base navale per il controllo dei rifornimenti di Pisa e la foce dell’Arno e come scalo dei grani maremmani), si era già manifestato in precedenza, con la realizzazione di una fortezza sul mare, la Fortezza Vecchia, edificata su progetto di Antonio da Sangallo nel secondo decennio del Cinquecento.

All’epoca, l’impianto del porto e la sua fortificazione si presentarono quale obiettivo preponderante rispetto alla struttura urbana presente, che venne in gran parte sostituita dalla fabbrica della Fortezza, edificio che restò al centro dei piani architettonici della città fino a tutto il Seicento.

Grandi opere furono effettuate da Ferdinando I Medici, intenzionato a realizzare un porto adatto per costituire un’armata navale in piena regola, e una efficace marina mercantile. Il progetto era già stato tentato dal padre Cosimo I e dal fratello Francesco alla torre del Fanale, ma la violenza delle intemperie e delle correnti marine l’avevano inesorabilmente fatto fallire. La decisione di Ferdinando I di costruire un canale fra Pisa e Livorno, il Canale dei Navicelli, seguendo la traccia del più antico Canale omonimo, per rendere più agevole e sicuro il traffico delle merci, fu determinante per lo sviluppo del commercio e del porto livornese. Questa importante opera idraulica fu iniziata nel 1560, partendo da Pisa, con il taglio di un primo tratto, fino a S.Piero a Grado, per continuare poi verso il padule di Stagno ed entrare quindi in Livorno. Successivamente, nuovi canali vennero scavati per garantire più agile accesso a quello che si voleva diventasse il nuovo porto di tutto il granducato. Dal 1580 in poi, si assiste ai primi lavori per la realizzazione di più adeguate strutture portuali, si scavano la darsena e si avviano i lavori dei moli, oltre che provvedere alle prime misure di sanità, con la costruzione di un secondo lazzaretto, quello di San Rocco, al quale se ne aggiungerà un terzo verso il 1643, in località detta di San Jacopo.
Sulla stessa linea, si inserisce l’instaurazione, nel 1606, del nuovo Capitanato di Livorno, che allargò notevolmente i confini della vecchia giurisdizione, oltre ad ampliarne le potenzialità economiche, mentre le esenzioni ed i privilegi emanati dal granduca agli inizi degli anni ’90 a favore di quanti si fossero stabiliti nel territorio livornese contribuirono significativamente al popolamento della città.

Cosimo II rese a Livorno un servizio incomparabile compiendo grandiosi lavori per la costruzione del molo, essenziale per rendere la rada sicura per un consiederevole numero di vascelli. Lo sviluppo del porto e del centro mercantile labronico si dovette soprattutto allo stabilirsi in città di gruppi di commercianti ed agenti marittimi stranieri, in prevalenza francesi, olandesi ed inglesi, ma anche greci, i quali vi trovavano tutti i vantaggi di una felice collocazione geografica, della modernità degli impianti e di una politica granducale all'insegna delle agevolazioni per le "nazioni" (vere e proprie comunità di una stessa nazionalità, amministrate secondo regole proprie e propri consoli) straniere stabilitevisi. Livorno divenne dunque un "porto franco" almeno dal 1565, status privilegiato rafforzato periodicamente dalle iniziative granducali, fino alla definitiva riforma di Cosimo III del 1676.
A tale felice condizione però, non corrispose un correlato vantaggio per il resto della regione, perché il porto labronico funzionò piuttosto come un luogo di transito, un punto di collegamento e di smercio per i mercanti stranieri, senza però riuscire a divenire mai un efficace sbocco per la produzione toscana, la cui economia attraversò invece un grave periodo di crisi.

In seguito, con il crescente sviluppo delle attività portuali e delle sue attrezzature, oltre che coll’insediamento, più o meno stabile nella struttura urbana, delle diverse Nazioni con i relativi interessi economici, si assiste alla domanda sempre più forte di spazi da destinarsi al deposito merci ed alle residenze dei mercanti, si costruiscono fabbriche civili e di servizio, si realizzano strutture destinate alla vita urbana e commerciale. Le molteplici opere di sistemazione architettonica sono effettuate grazie allo sfruttamento dell’abbondante mano d’opera disponibile, per lo più costituita da schiavi, forzati e contadini costretti al lavoro coatto.
La fisionomia della città cambia così drasticamente. La funzione difensiva delle fortificazioni viene progressivamente meno, prevalendo quella residenziale, mentre nella Fortezza Vecchia il granduca lorenese volle impiantare un’accademia militare, prima, ed il bagno penale, poi.

I lavori di Ferdinando I, intrapresi tra il 1590 e il 1591, tesi al potenziamento del porto labronico, videro la realizzazione di un nuovo bacino ad ampliamento della darsena preesistente. Con questo intervento il granduca mirava alla costituzione di un riparo da destinare alla sosta delle galere dell’Ordine di Santo Stefano e al varo alla riparazione delle imbarcazioni alloggiate negli arsenali livornesi.
Nel giro di un ventennio si conseguì in gran parte l’obbiettivo di fare di Livorno la base autosufficiente della marina mediceo-stefaniana. Rientra nel progetto di ridefinizione del ruolo della nuova città di Livorno, la costruzione del bagno delle galere, avvenuto tra il 1598 e il 1604. Si tratta di un fabbricato di enormi dimensioni, dotato di una struttura a quadrilatero, fornita di cisterna e pozzo, di un ospedale e di una spezieria, oltre che diuna fabbrica per la produzione di pane biscottato (uno dei principali alimenti degli equipaggi) e nel quale alloggiare le ciurme, gli schiavi e i buonavoglia, oltre che agli ufficiali addetti al controllo.
Nello stesso tempo, si provvede alla realizzazione di magazzini, arsenali e ferrerei per le galere, adiacenti alla darsena.