L’organizzazione interna e navale dell’Ordine stefaniano venne dunque disciplinata accuratamente negli statuti, aggiornati in varie edizioni, delle quali la principale è la seconda, del 1590, rimasta in vigore sino alla riforma lorenese del 1764.

Le gerarchie maggiori dell’Ordine e della Marina di S.Stefano sono le seguenti:

Il Gran Maestro
è il capo al quale obbediscono ciecamente tutti i cavalieri di qualsiasi grado e dignità; da lui, inoltre, dipendono tutti i ministri e gli altri membri dell’Ordine a qualsiasi titolo. Propone e promulga le leggi e le costituzioni, ed a lui solo spetta modificarle, l’abolirle, il farne delle nuove.

Il Commendatore Maggiore
rappresenta la dignità e preminenza sovrana, essendo eletto a vita dallo stesso Gran Maestro e rappresentandolo in tutte le prerogative col titolo di “luogotenente”.

Il Gran Contestabile
la sua autorità si estende sopra tutte le truppe da sbarco, specialmente durante le azioni terrestri. Dirige personalmente le forze di sbarco, richiedendo, quando necessario, l’intervento delle artiglierie delle navi.

L’Ammiraglio
dipendeva da questo ufficiale l’esito di tutte le imprese guerresche navali col complesso della flotta stefaniana, il suo ruolo era cioè in particolar modo legato all’onore della bandiera e dipendeva direttamente dal granduca.

Il Commissario generale delle galere
suoi compiti erano la custodia e la manutenzione della galere durante la navigazione e lo “scioverno”; fabbricazione, acquisto e manutenzione dell’equipaggiamento necessario, dal velame agli attrezzi, dal vestiario per la ciurma alla pece per calafatare le vele; alimentazione della ciurma; formazione dei ruoli di ufficiali, maestranze e marinai; erogazione delle paghe e inventariazione delle prede fatte e schiavi catturati.

Quanto ai cavalieri:

I “cavalieri militi”:

• per giustizia – ammessi cioè all’Ordine in virtù del superamento di un vero e proprio processo teso a verificare i quattro quarti di nobiltà del casato d’origine (le “provanze di nobiltà”), oltre a soddisfare un certo numero di requisiti (la nascita legittima, l’età superiore ai 17 anni, la buona condotta, la nascita in luoghi riconosciuti come città, il godimento di un patrimonio sufficiente a garantire uno stile di vita adeguato, il poter provare la residenza nelle maggiori magistrature cittadine dei propri antecedenti, il non aver mai esercitato arti vili o meccaniche);
  
• per commenda – ammessi a seguito della fondazione di una commenda di padronato, cioè di un patrimonio di beni mobili od immobili conferiti all’Ordine tramite la forma del fidecommesso (strumento questo di nobilitazione dei rappresentanti più facoltosi, ma non nobili, delle classi dirigenti toscane); di una commenda di grazia, conferita per volontà sovrana; o di una commenda di anzianità, assegnata ai cavalieri in base a diritti acquisiti dopo un certo tempo e in virtù dell’esercizio prestato nell’ambito delle attività della Religione.

I “cavalieri ecclesiastici”:

• cavalieri militi sacerdoti – tenuti a provare la propria nobiltà come i cavalieri per giustizia,
• cavalieri cappellani – ammessi senza esser sottoposti al processo di nobiltà.

I “cavalieri serventi”:

• serventi d’armi – col compito di ausilio dei cavalieri militi nelle imprese militari,
• serventi d’ufficio o tàu – addetti al servizio amministrativo e di cancelleria, o d’ausilio ai cavalieri durante la loro permanenza a Pisa.

I cavalieri rispondevano alla Regola di San Benedetto, con l’obbligo di carità, di castità coniugale (mantenendo cioè la possibilità di contrarre matrimonio, un particolare rilevante per favorire l’adesione delle aristocrazie e nobiltà toscane, assai sensibili alla necessità di sopravvivenza del proprio casato), di ubbidienza ai propri superiori ed alle norme statutarie.

Gli statuti riservavano alla disciplina norme dettagliate e severissime. Vi erano poi dei regolamenti separati, redatti in vista di spedizioni specifiche o in occasioni particolari, che venivano rinnovati e riformati periodicamente. Regole minuziose regolavano poi l’imbarco, impartite di volta in volta alla bisogna dai comandanti in carica. Si dica, a onor del vero, che i cavalieri non mancarono di dare segni di insubordinazione e di arroganza, insofferenti alle costrizioni, spesso ricorrevano ad esenzioni più o meno giustificate per evitare d’imbarcarsi.

La loro tracotanza divenne presto proverbiale, nnostante i richiami e le rpetute punizioni impartite dagli organi deputati al controllo disciplinare.
Si ricordi solo un episodio particolarmente violento, occorso nell’estate del 1568, quando otto cavalieri irruppero nel monastero di San Jacopo, a Firenze, violentando alcune monache.

Tra le regole più comuni stabilite per mantenere l'ordine a bordo, significative perché testimoniano la necessità di regolare comportamenti ben precisi, si ricordano il divieto di portare con sé eccesso di bagagli o di vestiario, dormire nell’alloggio assegnato e non a poppa (più confortevole, ma riservata al capitano ed agli ufficiali), di comportarsi onestamente con servitù e equipaggio, di non scendere a terra senza previo permesso.
Anche per le più alte gerarchie vigeva una certa severità, come dimostra quanto avvenne nel 1586, quando un capitano che non aveva obbedito all’ordine di attacco dell’ammiraglio fu strangolato e gettato a mare.